වේගවත් පියවර එක් පියවරක් RT-PCR කට්ටලය

A-1 RNA පිරිහී ඇත

—— කිසිදු අපිරිසිදුකමක් නොමැතිව උසස් තත්වයේ ආර්එන්ඒ පිරිසිදු කරන්න. ආර්එන්ඒ හායනය වැළැක්වීම සඳහා ආර්එන්ඒ ලබා ගන්නා ද්‍රව්‍ය හැකිතාක් නැවුම් විය යුතුය. ආර්ටී ප්‍රතික්‍රියාවට පෙර ඩීඑන්ඒටඩ් ජෙල් වල ආර්එන්ඒ අඛණ්ඩතාව විශ්ලේෂණය කරන්න. ආර්එන්ඒ නිස්සාරණය කිරීමෙන් පසු එය 100% ෆෝමමයිඩ් වල ගබඩා කළ යුතුය. ආර්එන්ඒඑස් නිෂේධකය භාවිතා කරන්නේ නම්, උනුසුම් උෂ්ණත්වය <45 ° C විය යුතු අතර, පීඑච් අගය 8.0 ට වඩා අඩු විය යුතුය, එසේ නොමැතිනම් නිෂේධනය මඟින් බන්ධනය වූ සියලුම ආර්එන්ඒඑස් මුදා හරිනු ඇත. තවද, N 0.8 mM DTT අඩංගු ද්‍රාවණ සඳහා RNase නිෂේධකය එකතු කළ යුතුය.

A-2 RNA වල ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියා වල නිෂේධක ඇත

——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————— නිෂේධක ඉවත් කිරීම සඳහා ආර්එන්ඒ වර්ෂාපතනය 70% (v/v) එතනෝල් වලින් සෝදන්න.

සීඩීඑන්ඒ හි පළමු කෙඳි සංශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන ප්‍රාථමික ප්‍රමාණවත් ලෙස ඇමීනියම් කිරීම ඒ -3

———————————————————————————————————————————— සසම්භාවී ෂඩාස්රාකාර සඳහා, ප්‍රතික්‍රියා උෂ්ණත්වය ළඟා වීමට පෙර විනාඩි 10 ක් සඳහා උෂ්ණත්වය 25 ° C දී තබා ගැනීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ. ජාන විශේෂිත ප්‍රයිමර් (ජීඑස්පී) සඳහා වෙනත් ජීඑස්පී උත්සාහ කරන්න, නැතහොත් ඔලිගෝ (ඩීටී) හෝ අහඹු ෂඩාස්රකය වෙත මාරු වන්න.

A-4 ආරම්භක ආර්එන්ඒ කුඩා ප්‍රමාණය

—— RNA ප්‍රමාණය වැඩි කරන්න. 50 ng ට අඩු ආර්එන්ඒ සාම්පල සඳහා 0.1 μg සිට 0.5 μg ඇසිටිල් බීඑස්ඒ පළමු කෙඳි සීඩීඑන්ඒ සංස්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කළ හැකිය.

A-5 විශ්ලේෂණය කරන ලද පටක වල ඉලක්කගත අනුපිළිවෙල ප්‍රකාශ නොවේ.

—— අනෙකුත් පටක උත්සාහ කරන්න.

A-6 PCR ප්‍රතික්‍රියාව අසමත් වේ

—— පියවර දෙකක ආර්ටී-පීසීආර් සඳහා, පීසීආර් පියවරේ සීඩීඑන්ඒ අච්චුව ප්‍රතික්‍රියා පරිමාවෙන් 1/5 නොඉක්මවිය යුතුය.

A-1 ප්‍රයිමර් සහ සැකිලි නිශ්චිත නොවන ඇනීම

ප්‍රයිමර් වල 3'-අන්තයේ 2-3 dG හෝ dC අඩංගු නොවිය යුතුය. අහඹු ප්‍රයිමර් හෝ ඔලිගෝ (ඩීටී) වෙනුවට පළමු කෙඳි සංස්ලේෂණයේදී ජාන-විශේෂිත ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන්න. පළමු චක්‍ර කිහිපය තුළදී වැඩි neණ උෂ්ණත්වයක් භාවිතා කරන්න, පසුව අඩු උෂ්ණත්ව වර්‍ගයක් භාවිතා කරන්න. ප්‍රතික්‍රියාවේ නිශ්චිතභාවය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා පීසීආර් සඳහා උණුසුම් ආරම්භක ටාක් ඩීඑන්ඒ පොලිමරේස් භාවිතා කරන්න.

A-2 ජාන විශේෂිත ප්‍රයිමර් වල දුර්වල සැලසුම

—— විස්තාරණ ප්‍රාථමික සැලසුම සඳහා එකම මූලධර්ම අනුගමනය කරන්න.

ඒ -3 ආර්එන්ඒ ජානමය ඩීඑන්ඒ වලින් දූෂිතයි

—— PCR ශ්‍රේණියේ DNase I සමඟ ආර්එන්ඒ වලට ප්‍රතිකාර කරන්න. ඩීඑන්ඒ දූෂණය හඳුනා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමකින් තොරව පාලන ප්‍රතික්‍රියාවක් සකසන්න.

A-4 ප්‍රාථමික ඩිමර් සෑදීම

—— 3 'අන්තයේ අනුපූරක අනුපිළිවෙලකින් තොරව ප්‍රාථමික සැලසුම් කරන්න.

A-5 ඉතා ඉහළ Mg²⁺ සාන්ද්රණය

—— Mg උපරිම කරන්න²⁺ එක් එක් සැකිල්ල සහ ප්‍රාථමික සංයෝජනය සඳහා සාන්ද්‍රණය

A-6 විදේශීය DNA වලින් දූෂිතයි

—— aerosol- ප්‍රතිරෝධී උපදෙස් සහ UDG එන්සයිම භාවිතා කරන්න.

A-1 පළමු කෙඳි නිෂ්පාදනයේ අන්තර්ගතය ඉතා ඉහළ ය

—— සාම්ප්‍රදායික PCR ප්‍රතික්‍රියා පියවරේදී පළමු කෙඳි නිෂ්පාදනයේ ප්‍රමාණය අඩු කරන්න.

A-2 PCR ප්‍රතික්‍රියාවේදී ප්‍රයිමර් ප්‍රමාණය වැඩිය

—— ප්‍රාථමික ආදානය අඩු කරන්න.

A-3 බොහෝ සයිකල්

—— PCR ප්‍රතික්‍රියා කොන්දේසි උපරිම කර PCR චක්‍ර සංඛ්‍යාව අඩු කරන්න.

A-4 ඉතා අඩු සනීපාරක්ෂක උෂ්ණත්වය

—— නිශ්චිත නොවන ආරම්භ කිරීම සහ දිගු වීම වැළැක්වීම සඳහා උෂ්ණත්වය ඉහළ යාම.

ඒ -5 ඩීඑන්ඒ ඩීඑන්එස්එස්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එක්ස්;

ආර්ටී-පීසීආර් යනු ආර්එන්ඒ සීඩීඑන්ඒ වෙත ආපසු හරවා යැවීමයි, පසුව ප්‍රතිවර්තනය කරන ලද සීඩීඑන්ඒ ඉලක්කගත කොටස වැඩි කිරීම සඳහා පීසීආර් ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරන්න. අත්හදා බැලීමේ නිශ්චිත කොන්දේසි අනුව අහඹු ප්‍රාථමිකයන්, ඔලිගෝ ඩීටී සහ ජාන විශේෂිත ප්‍රයිමර් තෝරන්න. ඉහත සඳහන් සියළුම ප්‍රාථමික වර්‍ග කෙටි කෙස් යුකැරියෝටික් සෛල එම්ආර්එන්ඒ සඳහා කොණ්ඩා මෝස්තරයක් නොමැතිව භාවිතා කළ හැකිය.

අහඹු ප්‍රාථමිකය: කොණ්ඩා මෝස්තර ව්‍යුහය සහිත දිගු ආර්එන්ඒ සඳහා මෙන්ම ආර්ආර්එන්ඒ, එම්ආර්එන්ඒ, ටීආර්එන්ඒ වැනි සියලුම වර්ගවල ආර්එන්ඒ සඳහාද ඒවා ප්‍රධාන වශයෙන් භාවිතා කරනුයේ තනි අච්චුවේ ආර්ටී-පීසීආර් ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා ය.

ඔලිගෝ ඩීටී: පොලියඒ ටේලිං සහිත ආර්එන්ඒ සඳහා සුදුසු ය (ප්‍රොකරියොටික් ආර්එන්ඒ, යුකාරියොටික් ඔලිගෝ ඩීටී ආර්ආර්එන්ඒ සහ ටීආර්එන්ඒ වලට පොලිඒ වලිග නැත). ඔලිගෝ ඩීටී පොලියාඒ වලිගය සමඟ බැඳී ඇති හෙයින් ආර්එන්ඒ සාම්පල වල ගුණාත්මක භාවය ඉහළ මට්ටමක තිබිය යුතු අතර සුළු පරිහානියකින් වුවද පූර්ණ කාලීන සීඩීඑන්ඒ සංස්ලේෂණ ප්‍රමාණය බෙහෙවින් අඩු කරයි.

ජාන විශේෂිත ප්‍රාථමිකය: සැකිලි අනුපිළිවෙලට අනුපූරක, ඉලක්කගත අනුක්‍රමය දන්නා අවස්ථා සඳහා සුදුසු ය.

ක්රම දෙකක් තිබේ:

1. අභ්‍යන්තර යොමු කිරීමේ ක්‍රමය: න්‍යායට අනුව, සීඩීඑන්ඒ යනු විවිධ දිග වල ඩීඑන්ඒ කොටස් වන බැවින් විද්‍යුත් විච්ඡේදනයේ ප්‍රති result ලය ආලේප කරයි. ආර්එන්ඒ බහුලත්වය අඩු නම්, ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් හි කිසිදු නිෂ්පාදනයක් නොපෙන්වයි, නමුත් මෙයින් අදහස් කරන්නේ පීසීආර් මඟින් කිසිදු නිෂ්පාදනයක් වැඩි දියුණු නොවන බවයි. පොදුවේ, සීඩීඑන්ඒ හඳුනා ගැනීම සඳහා අභ්‍යන්තර යොමු කිරීම භාවිතා කළ හැකිය. අභ්‍යන්තර යොමුවේ ප්‍රතිඵල තිබේ නම්, සීඩීඑන්ඒ හි ගුණාත්මකභාවය මූලික වශයෙන් සහතික කළ හැකිය (අවස්ථා කිහිපයකදී, ඉලක්ක කරගත් ජාන ඛණ්ඩය දිගු නම්, ව්‍යතිරේකයන් තිබිය හැකිය).

2. මෙම සැකිල්ල මඟින් වර්‍ධනය කරන ලද දන්නා ජානයක් තිබේ නම්, මෙම ජානයේ ප්‍රාථමික මඟින් එය සත්‍යාපනය කළ හැකිය. අභ්‍යන්තර සමුද්දේශය විස්තාරනය කිරීම අනිවාර්යයෙන්ම සීඩීඑන්ඒ සමඟ ගැටළුවක් නොමැති බව අදහස් නොවේ. සීඩීඑන්ඒ හි අභ්‍යන්තර යොමු කිරීම් වල අධික ප්‍රමාණයක් ඇති හෙයින්, එය විස්තාරනය කිරීම පහසුය. විවිධ හේතූන් මත සීඩීඑන්ඒ අර්ධ වශයෙන් පිරිහී ගියහොත්, සම්භාවිතාවේ දෘෂ්ටි කෝණයෙන් බලන කල, අඩු බහුල ඉලක්ක ජාන වල පීසීආර් ප්‍රතිඵල කෙරෙහි බෙහෙවින් බලපානු ඇත. අභ්‍යන්තර යොමු කිරීම තවමත් බහුල මට්ටමක පවතින අතර, විස්තාරණයට බොහෝ විට බලපෑමක් සිදු නොවේ.

ආර්එන්ඒ අර්ධ වශයෙන් පිරිහීම. ආර්එන්ඒ වල අඛණ්ඩතාව හඳුනාගෙන පවිත්‍ර කරන්න

විවිධ විශේෂ වල ආර්එන්ඒ අන්තර්ගතය වෙනස් විය හැකි නමුත් පොදුවේ ගත් කල ලබාගත් මුළු ආර්එන්ඒ හි ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් වල පැහැදිලි 28 එස් සහ 18 එස් තීරු දෙකක් අඩංගු විය යුතු අතර කලින් කලාපයේ දීප්තිය දෙවැන්න මෙන් දෙගුණයක් වැඩි විය යුතුය. 5 එස් කලාපය පෙන්නුම් කරන්නේ ආර්එන්ඒ පිරිහී ඇති අතර එහි දීප්තිය පරිහානියේ ප්‍රමාණයට සමානුපාතික වන බවයි. අභ්‍යන්තර සමුද්දේශය සාර්ථකව විස්තාරනය කිරීම යන්නෙන් අදහස් කරන්නේ ආර්එන්ඒ සමඟ කිසිදු ගැටළුවක් නොමැති බව නොවේ, මන්ද අභ්‍යන්තර යොමුව බහුල බැවින්, හායනය දැඩි නොවන තාක් කල් ආර්එන්ඒ විස්තාරණය කළ හැකිය. OD₂₆₀/OD₂₈₀වර්ණාවලීක්ෂ දර්ශකය මඟින් මනිනු ලබන පිරිසිදු ආර්එන්ඒ අනුපාතය 1.9 ත් 2.1 ත් අතර විය යුතුය. ආර්එන්ඒ හි ප්‍රෝටීන් අපිරිසිදුකම කුඩා ප්‍රමාණයක් අනුපාතය අඩු කරයි. අගය ඉතා අඩු නොවන තාක් කල්, ආර්ටී වලට බලපෑමක් සිදු නොවේ. ආර්ටී සඳහා වඩාත්ම වැදගත් වන්නේ ආර්එන්ඒ අඛණ්ඩතාවයි.

අභ්‍යන්තර සමුද්දේශ ජානයේ ව්‍යාප්තියෙන් දැක්විය හැක්කේ ආර්ටී සාර්ථක වී ඇති බව පමණක් වන නමුත් එය සීඩීඑන්ඒ කෙඳි වල ගුණාත්මක භාවයට අනිවාර්යයෙන්ම සම්බන්ධ නොවේ. අභ්‍යන්තර යොමු කොටස් සාමාන්‍යයෙන් ප්‍රමාණයෙන් කුඩා වන අතර ප්‍රකාශනයෙන් ඉහළ බැවින් ඒවා ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේදී සාර්‍ථක කර ගැනීමට පහසු වේ. කෙසේ වෙතත්, ඉලක්ක කරගත් ජානයේ ප්‍රමාණය සහ ප්‍රකාශනය ජානයෙන් ජානයට වෙනස් වේ. සීඩීඑන්ඒ ගුණාත්මකභාවය විනිශ්චය කළ හැක්කේ අභ්‍යන්තර යොමු කිරීමකින් පමණක් නොව විශේෂයෙන් ඉලක්ක කරගත් කැබලි 2 kb ට වඩා වැඩි කාලයක් සඳහා පමණි.

සමහර සාම්පල වල සංකීර්ණ ද්විතියික ව්‍යුහයන් ඇත, නැතහොත් පොහොසත් ජීසී අන්තර්ගතයක් ඇත, නැතහොත් අඩු ප්‍රමාණවත් බවක් ඇත. මෙම අවස්ථා වලදී, ඉලක්කගත කැබැල්ලේ ප්‍රමාණය සහ නියැදිය අනුව සුදුසු ප්‍රතිලෝම පිටපත් තෝරා ගත යුතුය. උසස් ජීසී අන්තර්ගතය සහ සංකීර්ණ ද්විතීයික ව්‍යුහය සහිත ආර්එන්ඒ සැකිලි සඳහා ද්විතීයික ව්‍යුහය අඩු උෂ්ණත්වයකදී හෝ පොදු ප්‍රතිලෝම පිටපත් සමඟ විවෘත කිරීම දුෂ්කර ය. මෙම සැකිලි සඳහා ක්වාන්ට් රිවර්ස් ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් තෝරා ගත හැකිය, මන්ද එහි ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වය පැහැදිලිවම එම්-එම්එල්වී ශ්‍රේණියේ ප්‍රතිලෝම පිටපතට වඩා හොඳ වන අතර එමඟින් විවිධ ආර්එන්ඒ සැකිලි කාර්යක්ෂමව ප්‍රතිවර්තනය කළ හැකි අතර ආර්එන්ඒ සීඩීඑන්ඒ පළමු කෙඳි උපරිම ලෙස පරිවර්තනය කළ හැකිය. සාමාන්‍ය ප්‍රතිලෝම පිටපත් කට්ටලය භාවිතා කරන විට, 20 μl පද්ධතියට ඵලදායී ලෙස ආපසු හැරවිය හැක්කේ සම්පූර්ණ ආර්එන්ඒ 1 μg පමණි. කරුණාකර කට්ටලයේ උපරිම ආර්ටී ධාරිතාව කෙරෙහි අවධානය යොමු කරන්න. අච්චුව වැඩිපුර එකතු කළ හොත්, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම ආර්එන්ඒ වෙත බහුල ලෙස වාසිදායක වේ. එම නිසා පද්ධතියේ උපරිම ධාරිතාව නොඉක්මවීම හොඳය.

ඒ -1 නිර්ණය කරන්න ආර්එන්ඒ දැඩි ලෙස පිරිහී තිබේද සහ ආර්ටී සාර්‍ථකද යන්න

පොදුවේ ගත් කල, අභ්‍යන්තර යොමු විස්තාරණය අසාර්ථක වීමට හේතුව බොහෝ විට සිදුවන්නේ බරපතල ආර්එන්ඒ පිරිහීම හේතුවෙනි. තවත් විය හැකි හේතුවක් නම් ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ අසමත් වීමයි. සීඩීඑන්ඒ තනි කෙඳි වල ගුණාත්මකභාවය විනිශ්චය කිරීම සඳහා අභ්‍යන්තර යොමු වීම සම්මතයක් ලෙස භාවිතා කළ නොහැකි නමුත් ආර්එන්ඒ ගුණාත්මක භාවයේ ගැටලුවක් නොමැති නම් ආපසු හැරවීම සාර්ථක ද යන්න විනිශ්චය කිරීමට එය සම්මතයක් ලෙස භාවිතා කළ හැකිය. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාවලියේ වැදගත්ම දෙය නම් ප්‍රතික්‍රියා කාර්යක්ෂමතාව වැඩි කිරීම සඳහා නියත උෂ්ණත්වයක් සහ නියත ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියක් පවත්වා ගැනීමයි.

A-2 අභ්‍යන්තර සමුද්දේශ ජාන වර්‍ධනය කිරීම සඳහා වන ප්‍රාථමික යන්ත්‍ර විශ්වාසදායකද යන්න සහ පීසීආර් හි භාවිතා කරන ප්‍රතික්‍රියාකාරක වල ගැටළු තිබේ දැයි නිර්ණය කරන්න.

සාපේක්ෂ ප්‍රමාණනය සඳහා, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමට පෙර ආර්එන්ඒ ප්‍රමාණනය කළ යුතු අතර, බොහෝ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කට්ටල සඳහාද එය අවශ්‍ය වේ, උදාහරණයක් ලෙස ආර්එන්ඒ ආදානය 1 μg ලෙස ප්‍රමාණ කරන්න. ප්‍රතිවර්තනය කරන ලද සීඩීඑන්ඒ යනු ආර්එන්ඒ, ඔලිගෝ ඩීටී, එන්සයිම, ඩීඑන්ටීපී සහ සුළු ඩීඑන්ඒපී පවා මිශ්‍ර විසඳුමක් වන හෙයින් අපගමනය සිදුවනු ඇත, එබැවින් සීඩීඑන්ඒ නිවැරදිව ගණනය කළ නොහැක. එබැවින් ආර්එන්ඒ ප්‍රමාණනය අවශ්‍ය වේ. වෙනස් සාම්පල අතර ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව සලකා බැලීමේදී ලබා ගත් සීඩීඑන්ඒ ප්‍රමාණය සමාන විය යුතු අතර ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය මඟින් විවිධ ජාන වල ප්‍රකාශන මට්ටම් සමාන ආර්එන්ඒ ප්‍රමාණයෙන් සංසන්දනය කළ හැකිය. සාපේක්ෂ ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක පීසීආර් සිදු කිරීමේදී, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමෙන් පසු ප්‍රමාණාත්මක සීඩීඑන්ඒ අවශ්‍ය නොවිය හැක්කේ අභ්‍යන්තර යොමු ජානය යොමු කිරීමක් ලෙස ක්‍රියා කළ හැකි බැවිනි.

එය ප්‍රධාන වශයෙන් ජාන හා සම්බන්ධ වන අතර බොහෝ ජාන සඳහා දිගු කැබලි ආපසු හැරවීම කළ නොහැකි ය. පළමුවෙන්ම, ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව PCR වලට වඩා බෙහෙවින් අඩු ය. දෙවනුව, ජීසී පොහොසත් කලාපය සහ බොහෝ ජාන වල ද්විතියික ව්‍යුහය ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ පීසීආර් යන දෙකම සීමා කරයි. අවසාන වශයෙන්, PCR හි විශ්වාසවන්තභාවය සහ විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව එකවර සහතික කිරීම දුෂ්කර ය. ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී, විශේෂයෙන් ඔලිගෝ ඩීටී භාවිතා කරමින් අඩු පිටපත් ජාන සඳහා දිගු කැබලි ලබා ගැනීමට කිසිවෙකුට සහතික විය නොහැක. වැඩිපුර ජීසී සමඟ 5 'යූටීආර් සඳහා, එය වඩාත් දුෂ්කර ය. එම නිසා, අහඹු ප්‍රාථමිකයන් සමඟ පිටපත් කිරීම ආපසු හැරවීම, ඉලක්කගත කැබැල්ලේ ස්වාභාවික ඉරිතැලීම් ඇති ස්ථාන සොයා ගැනීම, කොටස් අනුව වැඩි කිරීම සහ පසුව ආහාර ජීර්ණය හා බන්ධනය සීමා කිරීම තවමත් සාධාරණ ක්‍රමයකි. පොදුවේ ගත් කල, 2 kb ට වඩා වැඩි කොටස් සෘජුවම විස්තාරණය කිරීම අපහසු නමුත් එය ලබා ගැනීම සැම විටම කළ නොහැකි දෙයක් නොවේ: 1. පළමුවෙන්ම, RNA/mRNA වල අඛණ්ඩතාව සහතික කිරීම සහ TRIZOL නිස්සාරණය කිරීම වඩාත් සුදුසු ය. 2. එම්-එම්එල්වී ආර්ටී-පීසීආර් කට්ටලය කෙලින්ම භාවිතා කළ හැකිය. ඇනීමේ කාලය වැඩි කර විස්තාරණ ක්‍රියාවලියේදී චක්‍ර ගණන වැඩි කරන්න. විකල්පයක් වශයෙන්, කූඩු කළ පීසීආර් යෙදිය හැකිය, නැතහොත් සාමාන්‍යයෙන් පීසීආර් වර්‍ධනය කිරීමට පෙර නියමිත පරිදි දීර්ඝ කළ යුතු සහ ඉවත් කිරීමේ කාලය තුළ ප්‍රතික්‍රියා එකක් හෝ දෙකක් සිදු කළ හැකිය, එමඟින් කොටස් දිගු කිරීමට උපකාරී වේ. පොලිමරේස් වල විශ්වාසවන්තභාවය කෙරෙහි අවධානය යොමු කරන්න. 3. නියම ප්‍රතිඵල ලබා ගැනීම සඳහා දිගු කාලීන ටාක් පීසීආර් හි භාවිතා කළ හැකිය. 4. ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශන යෙදුම සඳහා ඉහළ විශ්වාසවන්ත පොලිමරේස් යෙදිය යුතුය.

ටියැන්ජන් විසින් පිරිනමන ප්‍රතිලෝම පිටපත් වර්ග දෙකක් තිබේ: ක්වාන්ට්/කිං ආර්ටීස් සහ ටියාන්ස්ක්‍රිප්ට් එම්-එම්එල්වී. ඒවා අතර ඇති ප්‍රධාන වෙනස නම් ආදාන ප්‍රමාණයයි. ක්වොන්ට් යනු අද්විතීය ප්‍රතිලෝම පිටපතක් වන අතර එය මොලනි මුරීන් ලියුකේමියා වෛරසයෙන් ලබාගත් සාමාන්‍යයෙන් භාවිතා කරන එම්-එම්එල්වී වලට වඩා වෙනස් ය. ක්වොන්ට් යනු ඉංජිනේරු එස්කෙරිචියා කෝලි විසින් නැවත එකතු කරන ලද ඉහළ කාර්යක්ෂමතාවයකින් යුත් නව ප්‍රතිස්ථාපක පිටපතකි. ඉහළ ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම සහ ඉහළ අස්වැන්නක් සහිත ආර්එන්ඒ 50 ng-2 μg විස්තාරණය කිරීම සඳහා ක්වොන්ට් සුදුසු ය. සාමාන්‍ය එම්එම්එල්වී හෝ ඒඑම්වී සමඟ සසඳන විට ක්වොන්ටින්ගේ ලොකුම ලක්ෂණය නම් ආර්එන්ඒ සැකිලි සමඟ එයට දැඩි සම්බන්ධතාවයක් ඇති අතර ඉහළ උෂ්ණත්ව විභේදනයකින් තොරව පිටපත් සංකීර්ණ සංකීර්ණ ආපසු හැරවීමට හැකි වීමයි. උසස් ජීසී අන්තර්ගතය සහිත සැකිලි සඳහා, ප්‍රතිලෝම කාර්යක්ෂමතාව ඉහළ ය. කෙසේ වෙතත්, මෙම ප්‍රතිලෝම පිටපතෙහි ආර්එන්ඒඑස් එච් ක්‍රියාකාරකම ඇති අතර එය සීඩීඑන්ඒ නිෂ්පාදනයේ දිගට බලපානු ඇත (<4.5 kb සැකිලි සඳහා සුදුසු). සාම්ප්‍රදායික ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සඳහා, TIANScript MMLV ප්‍රතිලෝම පිටපත නිර්දේශ කෙරේ. මෙම ආර්ටීස් යනු ඉතා දුර්වල ආර්එන්ඒඑස් එච් ක්‍රියාකාරකම් සහිත වෙනස් කළ එන්සයිමයක් වන අතර එය දිගු (> 5 කි.බ.) සීඩීඑන්ඒ සංස්ලේෂණය සඳහා සුදුසු වේ.

සීඩීඑන්ඒ සංශ්ලේෂණය සහ විස්තාරණය අතර නල කවරය විවෘත නොකර එකම නලයක එක පියවරක් ආපසු හැරවීම සහ පීසීආර් විස්තාරණය සම්පූර්ණ කිරීම දූෂණය අවම කිරීමට උපකාරී වේ. ලබා ගත් සියලුම සීඩීඑන්ඒ සාම්පල විස්තාරණය සඳහා භාවිතා කරන බැවින් සංවේදීතාව වැඩි වන අතර සමස්ත ආර්එන්ඒ වලින් අවම වශයෙන් 0.01 pg වේ. සාර්ථක එක් පියවරක ආර්ටීපීසීආර් සඳහා සීඩීඑන්ඒ සංශ්ලේෂණය ආරම්භ කිරීම සඳහා සාමාන්‍යයෙන් ජාන විශේෂිත ප්‍රාථමික භාවිතා වේ. පියවර දෙකක ක්‍රමය එනම් ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ පීසීආර් විස්තාරණය පියවර දෙකකින් සිදු කෙරේ. මුලින්ම සීඩීඑන්ඒ ලබා ගැනීම සඳහා ආර්එන්ඒ අච්චුවකින් ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සිදු කෙරෙන අතර ලබා ගත් සීඩීඑන්ඒ විවිධ පීසීආර් ප්‍රතික්‍රියා එකකට හෝ වැඩි ගණනකට ලක් කෙරේ. සීඩීඑන්ඒ හි පළමු කෙඳි සංශ්ලේෂණයට මඟ පෙන්වීම සඳහා පියවර දෙකේ ක්‍රමයට ඔලිගෝ (ඩීටී) හෝ සසම්භාවී ප්‍රයිමර් භාවිතා කළ හැකි අතර නිශ්චිත සාම්පලයකින් සියලුම එම්ආර්එන්ඒ තොරතුරු ආපසු හරවා යැවිය හැකිය.