TIANSeq ඛණ්ඩය/අළුත්වැඩියා කිරීම/ටයිල් කිරීමේ මොඩියුලය

වර්තමානයේදී, ඉහළ තල අනුක්‍රමික තාක්‍ෂණය ප්‍රධාන වශයෙන් පදනම් වී ඇත්තේ ඊළඟ පරම්පරාවේ අනුක්‍රමික තාක්‍ෂණය මත ය. ඊළඟ පරම්පරාවේ අනුක්‍රමණය කිරීමේ තාක්‍ෂණයේ කියවීමේ කාලය සීමා වී ඇති හෙයින්, අපි අනුපිළිවෙල අනුව කුඩා කොටස් පුස්තකාල වලට පුර්ණ දිග අනුපිළිවෙල බිඳ දැමිය යුතුයි. විවිධ අනුක්‍රමික අත්හදා බැලීම් වල අවශ්‍යතාවයන්ට අනුව, අපි සාමාන්‍යයෙන් තෝරා ගන්නේ ඒකපුද්ගල අනුක්‍රමයක් හෝ ද්විත්ව අන්ත අනුක්‍රමයක් ය. දැනට ඊළඟ පරම්පරාවේ අනුක්‍රමික පුස්තකාලයේ ඩීඑන්ඒ කොටස් සාමාන්‍යයෙන් බෙදා හරිනු ලබන්නේ බීපී 200-800 අතර පරාසයක ය.

අ) ඩීඑන්ඒ ගුණාත්මක භාවයෙන් දුර්වල වන අතර නිෂේධක ඇත. එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය වැළැක්වීම සඳහා උසස් තත්ත්වයේ ඩීඑන්ඒ සාම්පල භාවිතා කරන්න.

ආ) ඩීඑන්ඒ පුස්තකාලය තැනීම සඳහා පීසීආර් රහිත ක්‍රමය භාවිතා කිරීමේදී ඩීඑන්ඒ සාම්පල ප්‍රමාණවත් නොවේ. ඛණ්ඩනය වූ DNA වල ආදානය 50 ng ඉක්මවන විට, පුස්තකාලය ඉදිකිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී PCR රහිත වැඩ ප්‍රවාහය තෝරා බේරා ගෙන සිදු කළ හැකිය. පුස්තකාලයේ පිටපත් අංකය සෘජුවම අනුපිළිවෙලට සකස් කළ නොහැකි තරම් අඩු නම්, ඇඩැප්ටර බන්ධනයෙන් පසු ඩීඑන්ඒ පුස්තකාලය පීසීආර් මඟින් වැඩි කළ හැකිය.

ඇ) ආර්එන්ඒ අපවිත්‍ර වීම සාවද්‍ය මුලික ඩීඑන්ඒ ප්‍රමාණනය වීමට තුඩු දෙයි ජානමය ඩීඑන්ඒ පිරිසිදු කිරීමේ ක්‍රියාවලියේදී ආර්එන්ඒ දූෂණය පැවතිය හැකි අතර එමඟින් පුස්තකාලය ඉදිකිරීමේදී ඩීඑන්ඒ ප්‍රමාණවත් නොවීමට හා ප්‍රමාණවත් නොවන ඩීඑන්ඒ පැටවීමට හේතු විය හැක. ආර්එන්ඒඑස් සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් ආර්එන්ඒ ඉවත් කළ හැකිය.

ඒ -1

අ) කුඩා කොටස් (60 බීපී -120 බීපී) පෙනේ කුඩා කොටස් සාමාන්‍යයෙන් ඇඩැප්ටර කැබලි හෝ ඇඩැප්ටර මඟින් සෑදු ඩිමර් වේ. ඇන්ජන්කෝට් ඒඑම්පූර් පිරිසිදු එක්ස්පී චුම්භක පබළු වලින් පිරිසිදු කිරීමෙන් මෙම ඇඩැප්ටර කොටස් ඵලදායීව ඉවත් කර අනුපිළිවෙලෙහි ගුණාත්මකභාවය සහතික කළ හැකිය.

ආ) පීසීආර් විස්තාරණයෙන් පසු පුස්තකාලයේ විශාල කැබලි දිස්වේ, ඇඩැප්ටරය සම්බන්ධ කිරීමෙන් පසු පුස්තකාල ඩීඑන්ඒ කැබැල්ලේ ප්‍රමාණය බීපී 120 කින් වැඩි වේ. ඇඩැප්ටර බන්ධනයෙන් පසු ඩීඑන්ඒ කැබැල්ල බීපී 120 ට වඩා වැඩි වුවහොත් එයට හේතු විය හැක්කේ අධික පීසීආර් විස්තාරණය අසාමාන්‍ය ලෙස වැඩි වීමෙනි. පීසීආර් චක්‍ර ගණන අඩු කිරීමෙන් තත්වය වළක්වා ගත හැකිය.

ඇ) ඇඩැප්ටර බන්ධනයෙන් පසු පුස්තකාල ඩීඑන්ඒ කොටස් වල අසාමාන්‍ය ප්‍රමාණය මෙම කට්ටලයේ ඇඩැප්ටරයේ දිග 60 බීපී ය. කැබැල්ලේ කෙලවර දෙක ඇඩැප්ටරයට සම්බන්ධ කළ විට දිග වැඩි වන්නේ 120 bp පමණි. මෙම කට්ටලය මඟින් ලබා දුන් ඇඩැප්ටරය භාවිතා කරන විට, ඇඩැප්ටරයේ දිග වැනි අදාළ තොරතුරු සැපයීමට කරුණාකර සැපයුම්කරු සම්බන්ධ කර ගන්න. අත්හදා බැලීමේ වැඩ ප්‍රවාහය සහ ක්‍රියාකාරිත්වය අත්පොතෙහි දක්වා ඇති පියවරයන් අනුගමනය කරන බවට කරුණාකර සහතික වන්න.

)) ඇඩැප්ටර බන්ධනයට පෙර අසාමාන්‍ය ඩීඑන්ඒ කැබලි ප්‍රමාණය, ඩීඑන්ඒ ඛණ්ඩනය වීමේදී වැරදි ප්‍රතික්‍රියා තත්වයන් හේතුවෙන් මෙම ගැටලුවට හේතුව විය හැකිය. විවිධ ඩීඑන්ඒ ආදානයන් සඳහා විවිධ ප්‍රතික්‍රියා කාලය භාවිතා කළ යුතුය. ඩීඑන්ඒ ආදානය 10 එන්ජී ට වඩා වැඩි නම්, ප්‍රශස්තිකරණය සඳහා ආරම්භක කාලය ලෙස මිනිත්තු 12 ක ප්‍රතික්‍රියා කාලය තෝරා ගැනීමට අපි නිර්දේශ කරන අතර, මෙම අවස්ථාවේදී නිපදවන කැබලි ප්‍රමාණය ප්‍රධාන වශයෙන් 300-500 බීපී පරාසයේ පවතී. අවශ්‍ය ප්‍රමාණයට ඩීඑන්ඒ කොටස් ප්‍රශස්තිකරණය කිරීම සඳහා පරිශීලකයින්ට තමන්ගේම අවශ්‍යතා අනුව ඩීඑන්ඒ කැබලි වල දිග මිනිත්තු 2-4 දක්වා වැඩි කිරීමට හෝ අඩු කිරීමට හැකිය.

ඒ -2

අ) ඛණ්ඩනය වීමේ කාලය ප්‍රශස්තිකරණය කර නොමැත, ඛණ්ඩනය වූ ඩීඑන්ඒ ඉතා කුඩා හෝ විශාල නම්, ප්‍රතික්‍රියා කාලය තීරණය කිරීම සඳහා උපදෙස් වල දක්වා ඇති ඛණ්ඩනය වීමේ කාලය තෝරා ගැනීම සඳහා වන මාර්ගෝපදේශ කරුණාකර මෙම කාල සීමාව පාලනය කිරීමක් ලෙස භාවිතා කරන්න. ඛණ්ඩනය වීමේ කාලය පිළිබඳව වඩාත් නිවැරදි ගැලපීමක් සිදු කිරීම සඳහා මිනිත්තු 3 ක් දිගු කිරීමට හෝ කෙටි කිරීමට ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය.

ඒ -3

ඛණ්ඩනය වීමෙන් පසු ඩීඑන්ඒ අසාමාන්‍ය ලෙස බෙදා හැරීම

අ) ඛණ්ඩනය කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයේ වැරදි දියවන ක්‍රමය, නැතහොත් ප්‍රතික්‍රියාකාරකය දියවීමෙන් පසු මුළුමනින්ම මිශ්‍ර නොවේ. 5 × විඛණ්ඩන එන්සයිම මිශ්‍ර ප්‍රතික්‍රියාකාරකය අයිස් මත දිය කරන්න. දිය වූ පසු, ප්‍රතික්‍රියාකාරකය ඒකාකාරව මිශ්‍ර කර නලයේ පතුල මෘදු ලෙස සොලවන්න. ප්‍රතික්‍රියාකාරකය භ්‍රමණය නොකරන්න!

ආ) ඩීඑන්ඒ ආදාන සාම්පලයේ ඊඩීටීඒ හෝ වෙනත් දූෂක අඩංගු වන අතර ලුණු අයන ක්ෂය වීම සහ ඩීඑන්ඒ පිරිසිදු කිරීමේ පියවරේදී චෙලේටිං කාරක අත්හදා බැලීම සාර්ථක වීමට අත්‍යාවශ්‍ය වේ. ඩීඑන්ඒ 1 × ටීඊ හි දිය වී ඇත්නම්, ඛණ්ඩනය කිරීම සඳහා උපදෙස් වල දක්වා ඇති ක්‍රමය භාවිතා කරන්න. ද්‍රාවණයේ ඊඩීටීඒ සාන්ද්‍රණය අවිනිශ්චිත නම්, ඩීඑන්ඒ පිරිසිදු කර පසුව ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා එය දිය නොකළ ජලයේ දිය කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.

ඇ) සාවද්‍ය මුලික ඩීඑන්ඒ ප්‍රමාණනය, ඛණ්ඩනය වූ ඩීඑන්ඒ ප්‍රමාණය ඩීඑන්ඒ ආදාන ප්‍රමාණයට සමීපව සම්බන්ධ වේ. ඛණ්ඩනය වීමට පෙර, ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියේ ඩීඑන්ඒ ප්‍රමාණය නිශ්චිතව නිශ්චය කර ගැනීම සඳහා කුබිට්, පිකෝග්‍රීන් සහ වෙනත් ක්‍රම උපයෝගී කරගනිමින් ඩීඑන්ඒ නිවැරදිව ගණනය කිරීම අත්‍යවශ්‍ය වේ.

 )) ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය සකස් කිරීම උපදෙස් අනුගමනය නොකරයි. කොටස් වලට කැඩුණු ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියක් සකස් කිරීම උපදෙස් අනුව දැඩි ලෙස අයිස් මත සිදු කළ යුතුය. හොඳම ප්‍රතිඵලය සහතික කිරීම සඳහා සියලුම ප්‍රතික්‍රියා සංරචක අයිස් මත තැබිය යුතු අතර ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය සකස් කිරීම සම්පූර්ණ සිසිලනයෙන් පසුව සිදු කළ යුතුය. සකස් කිරීම අවසන් වූ පසු, හොඳින් මිශ්‍ර කිරීම සඳහා ෆ්ලික් කරන්න හෝ පයිප්ප දමන්න. සුළි සුළඟ එපා!

1. නුසුදුසු මිශ්‍ර කිරීමේ ක්‍රමය (සුළි, ප්‍රචණ්ඩ දෝලනය, ආදිය) පුස්තකාල කොටස් අසාමාන්‍ය ලෙස බෙදා හැරීමට හේතු වේ (පහත රූපයේ දැක්වෙන පරිදි) එමඟින් පුස්තකාලයේ ගුණාත්මක භාවයට බලපායි. එම නිසා, ඛණ්ඩනය වීමේ මිශ්‍ර ප්‍රතික්‍රියා ද්‍රාවණය පිළියෙල කරන විට, මිශ්‍ර කිරීම සඳහා මෘදු ලෙස ඉහළට හා පහළට පයිප්ප සවි කරන්න, නැතහොත් ඇඟිලි තුඩුව භාවිතා කර ඒකාකාරව මිශ්‍ර කරන්න. සුළි සුළඟ සමඟ මිශ්‍ර නොවීමට ප්‍රවේශම් වන්න.

2. පුස්තකාලය ඉදිකිරීම සඳහා ඉහළ පාරිශුද්ධත්වයේ ඩීඑන්ඒ භාවිතා කළ යුතුය

DNA හොඳ ඩීඑන්ඒ අඛණ්ඩතාව: විද්‍යුත් විච්ඡේදක පටිය වලිගයකින් තොරව 30 kb ට වඩා වැඩිය

OD260/230:> 1.5

OD260/280: 1.7-1.9

3. ඩීඑන්ඒ ආදාන ප්‍රමාණය නිවැරදි විය යුතුය, නැනෝඩ්‍රොප් වලට වඩා ඩීඑන්ඒ ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා කුබිට් සහ පිකෝග්‍රීන් ක්‍රම භාවිතා කිරීමට යෝජනා කෙරේ.

4. ඩීඑන්ඒ ද්‍රාවණයේ ඊඩීටීඒ හි අන්තර්ගතය තීරණය කළ යුතුය ඛණ්ඩනය වීමේ ප්‍රතික්‍රියාවට එඩීටීඒ විශාල බලපෑමක් ඇති කරයි. ඊඩීටීඒ හි අන්තර්ගතය ඉහළ නම්, ඊළඟ පරීක්ෂණයට පෙර ඩීඑන්ඒ පිරිසිදු කිරීම සිදු කළ යුතුය.

5. ඛණ්ඩනය වීමේ ප්‍රතික්‍රියා විසඳුම අයිස් මත සකස් කළ යුතුය. ඛණ්ඩනය වීමේ ක්‍රියාවලිය ප්‍රතික්‍රියා උෂ්ණත්වයට හා වේලාවට සංවේදී වේ (විශේෂයෙන් වර්ධක එකතු කිරීමෙන් පසු). ප්‍රතික්‍රියා කරන වේලාවේ නිරවද්‍යතාවය සහතික කිරීම සඳහා කරුණාකර අයිස් මත ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය සකස් කරන්න.

6. ඛණ්ඩනය වීමේ ප්‍රතික්‍රියා කාලය නිවැරදි විය යුතුය. ඛණ්ඩනය වීමේ පියවරේ ප්‍රතික්‍රියා කාලය සෘජුවම ඛණ්ඩක නිෂ්පාදන වල ප්‍රමාණයට බලපාන අතර එමඟින් පුස්තකාලය තුළ ඩීඑන්ඒ කොටස් ප්‍රමාණය බෙදා හැරීමට බලපායි.

1. මෙම කට්ටලයට අදාළ වන්නේ කුමන ආකාරයේ සාම්පලයක්ද?

මෙම කට්ටලයේ අදාළ වන නියැදි වර්ගය හොඳ ආර්එන්ඒ අඛණ්ඩතාවයකින් යුත් සම්පූර්ණ ආර්එන්ඒ හෝ පිරිසිදු කළ එම්ආර්එන්ඒ විය හැකිය. පුස්තකාලය ඉදිකිරීම සඳහා මුළුමනින්ම ආර්එන්ඒ භාවිතා කරන්නේ නම්, ආර්ආර්එන්ඒ මුලින්ම ඉවත් කිරීම සඳහා ආර්ආර්එන්ඒ ක්ෂය කිරීමේ කට්ටලය (කැට්#4992363/4992364/4992391) භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.

2. මෙම කට්ටලය සමඟ පුස්තකාලයක් තැනීම සඳහා FFPE සාම්පල භාවිතා කළ හැකිද?

එෆ්එෆ්පීඊ සාම්පල වල එම්ආර්එන්ඒ සාපේක්ෂ දුප්පත්තාවයෙන් යම් තාක් දුරට පිරිහී යනු ඇත. පුස්තකාලය ඉදිකිරීම සඳහා මෙම කට්ටලය භාවිතා කරන විට, ඛණ්ඩනය වීමේ කාලය ප්‍රශස්තිකරණය කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ (ඛණ්ඩනය වීමේ කාලය කෙටි කිරීම හෝ කොටස් නොකිරීම).

3. නිෂ්පාදන අත්පොතෙහි දක්වා ඇති ප්‍රමාණ තෝරා ගැනීමේ පියවර භාවිතා කිරීමෙන් ඇතුළත් කළ කොටස සුළු වශයෙන් අපගමනය වීමට හේතු විය හැක්කේ කුමක් ද?

මෙම නිෂ්පාදන අත්පොතෙහි ප්‍රමාණ තෝරා ගැනීමේ පියවරට අනුකූලව ප්‍රමාණය තෝරා ගැනීම සිදු කළ යුතුය. අපගමනය තිබේ නම්, එයට හේතුව විය හැක්කේ චුම්භක පබළු කාමර උෂ්ණත්වයට සමබර නොවීම හෝ සම්පුර්ණයෙන්ම මිශ්‍ර නොවීම, නළය නිවැරදි නොවීම හෝ දියරය කෙලවරේ තිබීම විය හැකිය. අත්හදා බැලීම සඳහා අඩු අවශෝෂණ සහිත ඉඟි භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.

4. පුස්තකාල ඉදිකිරීමේදී ඇඩප්ටර් තෝරා ගැනීම

පුස්තකාල ඉදිකිරීම් කට්ටලයේ ඇඩැප්ටර ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් අඩංගු නොවන අතර, මෙම කට්ටලය TIANSeq ඒක-දර්ශක ඇඩැප්ටරය (ඉලුමිනා) (4992641/4992642/4992378) සමඟ භාවිතා කිරීම රෙකමදාරු කරනු ලැබේ.

5. පුස්තකාලයේ QC

පුස්තකාල ප්‍රමාණාත්මක හඳුනා ගැනීම: පුස්තකාලයේ ස්කන්ධ සාන්ද්‍රණය සහ මවුලික සාන්ද්‍රණය තීරණය කිරීම සඳහා පිළිවෙලින් කියුබිට් සහ qPCR භාවිතා කෙරේ. ක්‍රියාවලිය නිෂ්පාදන අත්පොතට අනුකූලව දැඩි ලෙස ක්‍රියාත්මක වේ. පුස්තකාලයේ සාන්ද්‍රණය සාමාන්‍යයෙන් එන්ජීඑස් අනුපිළිවෙලෙහි අවශ්‍යතා සපුරාලනු ඇත. පුස්තකාල බෙදා හැරීමේ පරාසය හඳුනා ගැනීම: පුස්තකාල බෙදා හැරීමේ පරාසය හඳුනා ගැනීම සඳහා Agilent 2100 ජෛව විශ්ලේෂක භාවිතා කිරීම.

6. වර්ධක චක්‍ර අංකය තෝරා ගැනීම

උපදෙස් වලට අනුව, පීසීආර් චක්‍ර ගණන 6-12 ක් වන අතර නියැදි ආදානය අනුව අවශ්‍ය පීසීආර් චක්‍ර ගණන තෝරා ගත යුතුය. ඉහළ අස්වැන්නක් ඇති පුස්තකාල වල සාමාන්‍යයෙන් විවිධ වර්‍ග වල විස්තාරණය සිදු වන අතර එය වේගවත් 2100 ජෛව විශ්ලේෂකය හඳුනා ගැනීමේදී ඉලක්කගත පරාසයේ උච්චතම අවස්ථාවෙන් පසුව තරමක් විශාල උච්චයකින් විදහා දක්වයි, නැතහොත් කියුබිට් සාන්ද්‍රණය qPCR ට වඩා අඩු ය. මෘදු වැඩි කිරීම සාමාන්‍ය සංසිද්ධියක් වන අතර එය පුස්තකාල අනුක්‍රමණයට සහ පසුව දත්ත විශ්ලේෂණයට බල නොපායි.

7. ඇජිලන්ට් 2100 ජෛව විශ්ලේෂකයේ හඳුනා ගැනීමේ පැතිකඩෙහි කරල් දිස් වේ

ඇජිලන්ට් 2100 ජෛව විශ්ලේෂක හඳුනා ගැනීමේ දී කරල් පෙනීම ඇති වන්නේ නියැදි අසමාන ලෙස කොටස් වීම නිසා යම් ප්‍රමාණයේ වැඩි කැබලි ප්‍රමාණයක් ඇති අතර පීසීආර් පොහොසත් කිරීමෙන් පසුව මෙය වඩාත් පැහැදිලි වනු ඇත. මෙම අවස්ථාවෙහිදී, ප්‍රමාණ තේරීම සිදු නොකිරීමට යෝජනා කෙරේ, එනම් කැබැලි බෙදීම කුඩා හා සංකේන්ද්‍රණය වන අතර අංශක 94 ක උෂ්ණත්වයකදී මිනිත්තු 15 ක් සඳහා ඛණ්ඩනය වීමේ තත්ත්‍වය සකසන්න, සමජාතීයතාව වැඩි කළ හැකිය.